¿Qué es una PCR digital multiplex?
El multiplexado en la PCR permite detectar más una molécula diana o secuencia diana en una sola reacción. El multiplexado con PCR digital (dPCR) puede obtenerse variando el tipo de fluorocromos utilizados. En el multiplexado multicolor tradicional, los elementos diana se diferencian utilizando una sonda por elemento diana en el cual la sonda se conjuga con colorantes de diferentes espectros de emisión. La mayoría de los instrumentos de dPCR ofrecen la detección de diferentes fluorocromos en al menos dos canales de detección dedicados. El QIAcuity Digital PCR System, por ejemplo, permite el multiplexado para diferenciar claramente hasta 12 elementos diana en la misma reacción.
Ventajas del multiplexado de dPCR
El multiplexado en la dPCR es un tema que cada vez genera más interés, debido a los numerosos beneficios del multiplexado con un sistema de dPCR. El método se puede utilizar para:
- Analizar varios elementos diana en una sola reacción
- Reducir los errores técnicos, como las inexactitudes del pipeteado
- Aumentar las posibilidades de detección de elementos diana
- Reducir la cantidad de muestra necesaria para el análisis
- Proporcionar un control interno directo de una reacción individual
- Ahorrar tiempo y reactivos para reducir el coste total
El multiplexado con PCR digital habilita varias aplicaciones que no son posibles o no son fáciles de realizar mediante ensayos de un solo color. Algunos de estos análisis incluyen:
- Variantes en el número de copias: Con un método duplex, emparejamiento de genes diana y de referencia para determinar su relación
- Variación bialélica de variantes de un solo nucleótido o inserciones/eliminaciones pequeñas: Método doble con dos sondas de hidrólisis, visualizadas con diagramas de dos colores (1)
- Genotipado: Recuento de cantidades de divisiones de grupos de positivo simple y doble (1)
Un instrumento de PCR digital con alta potencia de multiplexado le permite analizar varios elementos diana en una sola muestra con sensibilidad y reproducibilidad elevadas. Por ejemplo, el QIAcuity Digital PCR System ofrece varias configuraciones que se adaptan a sus necesidades para el análisis de muestras y elementos diana.
La ventaja de la PCR digital basada en nanoplacas para las reacciones multiplexadas
La PCR digital multiplex es un enfoque preferido, ya que el método es más flexible, sensible y específico que la qPCR multiplex. El multiplexado de la qPCR también podría requerir métodos más complicados para calcular los valores absolutos y el método es más susceptible a la interferencia de múltiples PCR en una reacción. Con las funciones del software, como una matriz de interferencias personalizada, puede abordar las señales de interferencias entre canales vecinos en función de sus parámetros de ensayo y análisis. Esto ayuda a aumentar aún más la capacidad de multiplexado de la dPCR y la precisión de los datos en comparación con la qPCR.
La PCR digital basada en nanoplacas ofrece distintas ventajas respecto de los otros tipos de PCR digital, entre las que se incluyen precisión y sensibilidad elevadas, así como opciones de multiplexado de orden superior, incluido el multiplexado de amplitud.
El instrumento QIAcuity ofrece seis colores que se pueden utilizar para la detección de elementos diana en seis canales más dos canales híbridos. Estos canales híbridos se utilizan para colorantes de gran corrimiento de Stokes (LSS). ¿Cómo funcionan estos colorantes? El desplazamiento espectral entre la luz absorbida y la luz emitida en los colorantes LSS es más largo en comparación con los colorantes de fluorescencia estándar. Esto significa que la absorción y la emisión se manipulan con canales diferentes; por ejemplo, la excitación ocurre con la longitud de onda del canal verde estándar, pero la emisión/adquisición de imágenes se consigue con el filtro amarillo. De este modo se facilita el análisis de reacciones de hasta 8 plex.
Para conseguir incluso más elementos diana, puede probar el multiplexado de orden superior. Con la posibilidad de multiplexado de amplitud en QIAcuity, mediante el QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit, puede analizar hasta 12 elementos diana. El multiplexado de amplitud cuantifica simultáneamente dos elementos diana en el mismo canal de color, duplicando efectivamente la salida de datos por reacción. El software QIAcuity (versión 3.1 y posteriores) admite el multiplexado de amplitud introduciendo tres umbrales ajustables dentro del canal para distinguir entre el elemento diana uno, el elemento diana dos y los positivos dobles. Con estos umbrales, puede analizar cada amplificación de elemento diana en la muestra.
Las funcionalidades avanzadas de multiplexado de orden superior optimizan los recursos del laboratorio y proporcionan una visión de alta resolución de las variaciones genéticas. Estas características son esenciales para aplicaciones como la variación del número de copias y la detección microbiana, en particular cuando las muestras están limitadas.
Características clave de la familia QIAcuity
Características de alto rendimiento y multiplexado del QIAcuity* Digital PCR System para uso en investigación no clínica y el QIAcuityDx** Digital PCR System para uso en diagnóstico in vitro
| QIAcuity* One 2plex | QIAcuity* One 5plex | QIAcuity* Four | QIAcuity* Eight | QIAcuityDx** Four | |
|---|---|---|---|---|---|
|
Canales de detección |
2 | 8a (6+2 híbridob) |
8a |
8a |
5 |
| Capacidad de multiplexado | 4 | 12c,a | 12c,a | 12c,a | 5 |
|
Número de muestras analizadas |
Hasta 384 |
Hasta 384 |
Hasta 672 |
Hasta 1248 |
Hasta 672 (en 96 pocillos)d Hasta 168 (en 24 pocillos) |
| Objetivo | Aplicaciones no clínicas | Aplicaciones de IVD | |||
¿Tiene más preguntas introductorias sobre el multiplexado de dPCR? Vea si nuestro QIAgenius puede responderlas:
Aplicaciones de dPCR multiplex
Consideraciones sobre la cuantificación exacta con PCR digital multiplex
- Optimizar ensayos individuales: Valide reacciones individuales antes del multiplexado de dPCR (por ejemplo, compruebe la presencia de dímeros)
- Evaluar cebadores y sondas: Compruebe la posible interacción entre los cebadores y las sondas
- Seleccionar cuidadosamente los colorantes: Elija los colorantes para cada ensayo cuidadosamente, seleccione colorantes con un fluorocromo brillante para elementos diana con bajo número de copias
- Comprobar la existencia de elementos diana ligados: Investigue el potencial de los elementos diana ligados o las correlaciones de elementos diana de orden superior; por ejemplo, utilice ensayos basados en enlaces para medir la configuración de cis frente a trans de los elementos diana y los posibles reordenamientos estructurales
- Evitar la hibridación cruzada: Si es posible, diseñe variaciones de sonda hacia el elemento diana que incluyan cambios en dos o más inserciones o deleciones de nucleótidos para evitar discordancias en las sondas
- Minimizar la filtración óptica: Se produce si más de un canal recoge la fluorescencia de un colorante; si es posible, trate de asegurarse de que los colorantes conjugados coincidan con los sistemas de detección óptica o ajuste los parámetros de procesamiento de señales en el software de análisis
- Solucionar los problemas de interferencias: Compruebe si su sistema dispone de funciones de software especializadas, como una matriz de interferencia personalizada, que puede ayudar a analizar la interferencia entre canales vecinos para todos los ensayos multiplexados y aumentar la confianza en sus datos.
- Reducir la presencia de efecto de lluvia: El efecto de lluvia describe el subconjunto de particiones que son superiores a las particiones negativas pero inferiores a las positivas. Puede reducir el efecto de lluvia reevaluando el tipo de molde, la confirmación, la integridad, la especificidad del ensayo y la presencia de inhibidores en la reacción; considere ajustar la posición de umbral de otra manera para evitar la influencia de la lluvia en la cuantificación
Comenzar con la dPCR multiplex
Si le interesa realizar una PCR digital multiplex, considere la posibilidad de invertir en un instrumento de dPCR con capacidades de multiplexado avanzadas. Existen varios kits de dPCR y ensayos de dPCR desarrollados para los ensayos de PCR digital multiplex que podrían aportar varios beneficios, tanto a principiantes como a expertos en multiplexado.
- Su instrumento de PCR digital: existen muchos tipos de sistemas de PCR digital disponibles, pero algunos ofrecen más opciones de multiplexado que otros. Con el QIAcuity dPCR System, puede preparar ensayos de 8 plex multiplexando hasta seis canales estándar y dos canales híbridos para colorantes LSS. Si utiliza los canales estándar para multiplexado de amplitud, puede aumentar las funcionalidades de multiplexado de QIAcuity a 12 plex.
| Canal | Excitación (nm) | Emisión (nm) | Fluorocromos de ejemplo |
|---|---|---|---|
| Verde | 463 – 503 | 519 – 549 | FAM™, EvaGreen® |
| Amarillo | 513–534 | 551–565 | HEX™, VIC® |
| Naranja | 541–563 | 582–608 | TAMRA™, Atto 550 |
| Rojo | 568–594 | 613–655 | ROX™, Texas Red® |
| Carmín | 588–638 | 656–694 | Cy5®, Quasar 680 |
| Rojo intenso | 651-690 | 709-759 | Cy5.5, Atto 680, Atto 700 |
| Verde/Amarillo | 463–503 | 551–565 | DY-482XL (LSS V/A)* |
| Naranja/Rojo | 541–563 | 613–655 | DY-540XL (LSS N/R)* |
- Sus kits de dPCR multifuncionales: considere usar kits de dPCR desarrollados para reacciones multiplexadas. El QIAcuity High Multiplex Probe PCR Kit es ideal para muestras complejas y multiplexado más allá de cinco elementos diana. Los QIAcuity Probe PCR Kits incluyen mezclas maestras especiales para cuantificar hasta cinco elementos diana de abundancia muy diversa en una QIAcuity Nanoplate. El multiplexado de dPCR le permite ahorrar tiempo, costes y material de muestra sin afectar la calidad o la validez de los datos.
- Kits de dPCR para análisis sin contaminación – Existen kits especializados para aplicaciones que requieren mezclas maestras ultralimpias que minimizan la contaminación del ADN de fondo. El QIAcuity UCP Probe PCR Kit es ideal para el análisis microbiano o para las aplicaciones de control de calidad, como las pruebas de ADN residual. Los kits ofrecen especificidad y exactitud elevadas en la cuantificación de ADNg o ADNc en ensayos de dPCR simple o 5 plex.
- Ensayos de dPCR multiplex específicos de la aplicación – Para aumentar el rendimiento y reducir los costes de acuerdo con aplicaciones específicas, se han desarrollado ensayos de dPCR con diferentes colorantes (FAM, HEX, ROX, Atto 500 y Cy5). Estos ensayos de dPCR multiplex permiten el diseño experimental flexible y el análisis multiplexado de hasta cinco elementos diana en una reacción. Se encuentran disponibles ensayos de dPCR específicos para análisis de CNV, detección de microbios, terapia celular y génica y ensayos de mutación LNA para mutaciones relacionadas con el cáncer.
Productos destacados para la PCR digital multiplex
Publicaciones con multiplexado de dPCR
| Aplicación | Uso de dPCR multiplex | Referencias |
|---|---|---|
| Investigation of the antimicrobial | Multiplex reverse transcription digital PCR | Rattanachak N, Weawsiangsang S, Jongjitvimol T, |
| Identification and deconvolution of mixtures of species commonly found in households for forensic purposes | Identified Homo sapiens, canine, feline, bovine swine, pisces, and gallus in two multiplexes | Ghemrawi M and McCord B. Development of a nanoplate-based digital PCR assay for species identification with mixture deconvolution. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 2022; 8:193–195. |
| Detection of SARS-CoV-2 Variants of Concern in Belgian Influent Wastewater | Targeted multiplex dPCR assay for detection of four different Variants of Concern (VOC) and quantification of the RNA from different SARS-CoV-2 VOC in influent wastewater | Booagaerts T et al. Optimization and application of a multiplex digital PCR assay for the detection of SARS-COV-2 variants of concern in Belgian influent wastewater. Viruses. 2022; 14(3):610. |
| Detection of gene fusions from RNA | Multiplexed primers in initial RT-PCR reaction in ASPYRE technology to identify 37 potential targets within the 3’ gene fusion families | Gray ER at al. Ultra-sensitive molecular detection of gene fusions from RNA using ASPYRE. BMC Medical Genomics. 2022; 15:215. |
Más recursos sobre dPCR múltiple
Otras referencias
- Whale AS, Huggett JF, Tzonev S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2016; 10:15–23.
- Izadpanah M et al. Simple and fast multiplex PCR method for detection of species origin in meat products. Journal of Food Science and Technology. 2017; 55(2): 698–703.
- Lee YM, Lee S, Kim HY. A multiplex PCR assay combined with capillary electrophoresis for the simultaneous identification of Atlantic cod, Pacific cod, blue whiting, haddock, and Alaska pollock. Foods. 2021; 10(11):2631.
- Pecoraro S et al. Overview and recommendations for the application of digital PCR. EUR 29673 EN, Publications Office of the European Union, Luxembourg, 2019. https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/doc/WG-dPCR-Report.pdf.
- Dobnik D, Spilsberg B, Bogožalec K, Holst-Jensen A and Žel J. Multiplex quantification of 12 European Union authorized genetically modified maize lines with droplet digital polymerase chain reaction. Analytical Chemistry. 2015; 87(16):8218–8226.
- Lao TD, Le TAH. Exploring the multiplex PCR for detection of animal-derived ingredients in vegetarian foods. Pharmacopore. 2020; 3.
- Boukharouba A, González A., García-Ferrús M., Ferrús A. Botella S. Simultaneous detection of four main foodborne pathogens in ready-to-eat-food by using a simple and rapid multiplex PCR (mPCR) assay. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2022; 19(3): 1031.
- Appay R et al. Multiplexed droplet digital PCR assays for the simultaneous screening of major genetic alterations in tumors of the central nervous system. Frontiers in Oncology. 2020; 10:579762.
- Peitz C et al. Multiplexed quantification of four neuroblastoma DNA targets in a single droplet digital PCR reaction. Journal of Molecular Diagnostics. 2020; 22(11):1309–1323.
- Jiang L et al. Development and validation of a 4-color multiplexing spinal muscular atrophy (SMA) genotyping assay on a novel integrated digital PCR instrument. Scientific Reports. 2020; 10: 19892.
- Oscorbin I, Kechin A, Boyarskikh U., Filipenko M. Multiplex ddPCR assay for screening copy number variations in BRCA1 gene. Breast Cancer Research and Treatment. 2019; 178(3):545–555.
- Hughesman CB et al. A robust protocol for using multiplexed droplet digital PCR to quantify somatic copy number alterations in clinical tissue specimens. PLOS ONE. 2016; 11(8): e0161274
- Yu Q. et al. Multiplex picoliter-droplet digital PCR for quantitative assessment of EGFR mutations in circulating cell-free DNA derived from advanced non-small cell lung cancer patients. Molecular Medicine Reports. 2017; 16(2):1157–1166.
- Andersen RF And Jakobsen A. Screening for circulating RAS/RAF mutations by multiplex digital PCR. Clinica Chimica Acta. 2016; 458:138–143.
- Corné J et al. Development of multiplex digital PCR assays for the detection of PIK3CA mutations in the plasma of metastatic breast cancer patients. Scientific Reports. 2021; 11(1):17316.
- Dong L et al. A rapid multiplex assay of human malaria parasites by digital PCR. Clinica Chimica Acta. 2023; 539:70–78.
- Shi K et al. A multiplex crystal digital PCR for detection of African Swine Fever Virus, Classical Swine Fever Virus, and Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus. Frontiers in Veterinary Science. 2022; 9:926881.
- Wu, J et al. Clinical validation of a multiplex droplet digital PCR for diagnosing suspected bloodstream infections in ICU practice: a promising diagnostic tool. Crit Care. 2022; 26: 243.
- Zhu X et al. Development of a multiplex droplet digital PCR assay for detection of enterovirus, parechovirus, herpes simplex virus 1 and 2 simultaneously for diagnosis of viral CNS infections. Virology Journal. 2022; 19:70.
- Maggi R, Breitschwerdt EB, Qurollo B, Miller JC. Development of a multiplex droplet digital PCR assay for the detection of Babesia, Bartonella, and Borrelia species. Pathogens 2021; 10(11):1462.
- Shin J et al. Duplex dPCR system for rapid identification of gram-negative pathogens in the blood of patients with bloodstream infection: A culture-independent approach. Journal of Microbiology and Biotechnology. 2021; 31(11):1481–1489.
- Te SH, Chen EY, Gin KYH. Comparison of Quantitative PCR and Droplet Digital PCR Multiplex Assays for Two Genera of Bloom-Forming Cyanobacteria Cylindrospermopsis and Microcystis. Applied and Environmental Microbiology. 2015; 81(15):5203–5211.
- Hayes D and Dobnik D. Commentary: Multiplex dPCR and SV-AUC are promising assays to robustly monitor the critical quality attribute of AAV drug product integrity. Journal of Pharmaceutical Sciences 111(8): 2143–2148.
- Nell RJ et al. Accurate quantification of T Cells in copy number stable and unstable DNA samples using multiplex digital PCR. Journal of Molecular Diagnostics. 2022; 24(1):88–100.
- Sanchez MEN et al. Multiplex reverse transcriptase droplet digital PCR for the simultaneous quantification of four dengue serotypes: Proof of concept study.2020; Biologicals 67:62–68.
- Meng P et al. Development of a multiplex dPCR assay for ERBB2 amplification in breast cancer. European Journal of Cancer. 2022; 175(1):S80.
- Morisset D, Štebih D, Milavec M, Gruden K, Žel J. Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR. PLoS One. 2013; 8(5): e62583.
- Oscorbin IP et al. Multiplex droplet digital PCR assay for detection of MET and HER2 genes amplification in non-small cell lung cancer. Cancers (Basel). 2022; 14(6):1458.
- Center for Breakthrough Medicines. https://breakthroughmedicines.com/all/tech-note-high-throughput-aav-viral-titering-using-nanoplate-based-digital-pcr/ (último acceso el 21 de abril de 2023)